El diagnóstico de la legionelosis puede realizarse por aislamiento del agente causal a partir de muestras respiratorias, por detección de antígenos en muestras del foco de infección o de orina (donde se eliminan) o también mediante la detección de anticuerpos específicos por serología. El aislamiento del microorganismo por cultivo a partir de muestras clínicas constituye la técnica de elección, que permite también identificar toda las especies del género y serogrupos de Legionella pneumophila. Si las muestras seleccionadas son adecuadas, tiene una sensibilidad del 70% y una especificidad del 100%. El medio de cultivo más utilizado es el agar BCYE a. Se trata de un medio enriquecido que contiene, entre otros ingredientes, extracto de levadura, L-cisteína, pirofosfato férrico y a ketoglutarato.

Este medio se hace selectivo mediante la adición de una mezcla de antibióticos para evitar el crecimiento de la flora comensal. Sin embargo, es conveniente sembrar siempre un medio sin antibióticos, ya que algunas especies del género Legionella, diferentes a L . pneumophila, pueden ser inhibidas por los antibióticos contenidos en el medio selectivo.

La detección directa en muestras respiratorias de L. pneumophila serogrupo 1 por técnicas de inmunofluorescencia directa (IFD) tiene una sensibilidad que oscila entre el 25-70% y una especificidad del 95%. Los falsos positivos de la técnica se deben habitualmente a reacciones cruzadas otras bacterias.

La detección de antígeno soluble de Legionella en orina es una técnica de diagnóstico rápido de la neumonía por Legionella disponible desde hace menos de una década, que tiene una sensibilidad (60-90%) y especificidad elevadas (99%). La primera prueba disponible comercialmente fue una técnica de radioinmunoensayo (RIA), que exigía disponer de unas instalaciones adecuadas para trabajar con radioisótopos. La sustitución de aquella por una técnica de enzimoinmunoensayo (EIA) y de inmunocromatografía de membrana ha permitido su incorporación a muchos laboratorios.La concentración del antígeno presente en la orina mediante ultrafiltración selectiva u otros métodos, incrementa significativamente la sensibilidad de las técnicas descritas sin afectar a la especificidad. Todas estas técnicas detectan con una gran sensibilidad antígeno soluble de L. pneumophila seogrupo 1, siendo también capaces con mayor o menor eficacia de detectar otros serogrupos de L.Pneumophila, así como otras especies de Legionella. El antígeno de Legionella es detectable en orina desde el inicio de los síntomas y en algunos casos hasta muchos meses después, sin influir la administración previa de antibióticos.

Las técnicas serológicas únicamente permiten realizar un diagnóstico retrospectivo. Se requieren dos muestras de suero, la primera obtenida en la fase aguda de la enfermedad y la segunda a las 6-8 semanas, dado que aproximadamente un 15% de los pacientes seroconvierten después de 6 semanas. La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es la técnica más utilizada, considerándose diagnóstico el aumento de cuatro veces el título de anti- cuerpos en la segunda muestra de suero respecto a la primera, siempre que el título de la segunda sea ›=1/128. La sensibilidad de esta técnica es de 40-60% y la especificidad de esta técnica es de 40-60% y la especificidad de 96-99%.